HAMP Domänen-vermittelte Signalübertragung

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HAMP Domänen-vermittelte Signalübertragung: Mutagenese Untersuchungen und biochemische Charakterisierung Die Signalübertragung durch die Zellmembran stellt einen wichtigen Vorgang dar, deren molekularen Mechanismen noch weit unbekannt sind. Eine wichtige Eigenschaft von Transmembransignalproteinen ist ihre Modulare Architektur. Sie besitzen eine periplasmische Sensordomäne, ein oder mehrere Transmembran-Segmente und eine cytoplasmische Output-oder transmitter-Domäne. Extra- und intrazelluläre Domänen werden häufig durch kleine Regionen verbunden. Diese Regionen unterziehen Konformationsänderungen, um das Signal weiterzuleiten. Auf diesem Grund sind sie für Untersuchungen der Signalübertragung interessant. Eine dieser Regionen, ist die weit verbreitete HAMP Domäne. Das Akronym HAMP steht für das Vorkommen dieser Domäne in Histidinkinasen, Adenylatcyclasen, Methyl-akzeptierende Chemotaxis Proteinen und Phosphatasen. Diverse Mutationsanalysen haben gezeigt, dass sie für den Signaltransfer von entscheidender Bedeutung sind. Somit ist die Untersuchung der Signalmechanismus der HAMP-Domäne zum Verständnis der Signalweiterleitung wichtig. HAMP Domänen bestehen aus zwei amphiphatischen alpha-Helices mit coiled-coil Eigenschaften, die durch einen nicht-helikallen Konnektor miteinander verbunden sind. Die Struktur der HAMP Domäne aus dem Protein Af1503 des Archaeons Archaeoglobus fulgidus wurde im Jahr 2006 bei der Gruppe von A.Lupas am Max Plank Institut gelöst und zeigt ein homodimeres und paralleles coiled-coil 4-Helix-Bündel mit einer ungewöhnlichen Kernpackung. Auf der Grundlage dieser Struktur wurde ein Modell für die Membransignalübertragung vorgeschlagen, in dem HAMP-Domänen infolge konzertierter Rotation aller 4 Helices zwischen der beobachteten Geometrie und einem kanonischen knobs-into-holes wechseln. Jede dieser Konformationen würde einem definierten Signalzustand entsprechen. Benachbarte Helices rotieren jeweils um 26° in entgegengesetzten Richtungen, so dass der Mechanismus an ein Getriebe erinnert. Dieses Getriebe-Model ("gearbox" Model) ist noch umstritten, dennoch scheint eine Konformationsänderung zwischen zwei Zuständen der zugrunde liegende Mechanismus der HAMP Domäne zu sein. Ziel dieser Arbeit war die Erforschung des molekularen Mechanismus der HAMP Domänen bei der Signalübertragung durch eine strukturbasierte biochemische Untersuchung. Dabei wurde versucht, folgende wichtige Fragen zu beantworten: - Wie wird das Signal aus der Membran aufgenommen? - Wie lässt sich die Konformationsänderung der HAMP Domäne modulieren und welche Reste sind für ihre Funktion wichtig? - Wie übermittelt die HAMP Domäne das Signal an die nächste Domäne? Die katalytische Domäne der mykobakteriellen Rv3645 Adenylatcyclase diente als biochemischer Reporter. Um die Funktion der HAMP Domäne in der Signalweiterleitung zu untersuchen, wurde eine Chimäre gewählt, die aus dem Rezeptorbereich des E.coli Serinrezeptors Tsr, der Af1503 HAMP und der katalytischen Domäne der Rv3645 besteht. Sie zeigte keine Serin-Regulation, obwohl eine vergleichbare Chimäre mit Tsr HAMP durch Serin gehemmt wurde. Durch den Austausch bestimmter Positionen zwischen der Tsr- und der Af1503 HAMP Domänen wurde die Konformationsänderung der HAMP Domäne moduliert und dabei einer Rolle diese Reste in der Signalübertragung festgestellt. Weitere Untersuchungen offenbaren die Schlüsselrolle eines strukturellen Netzwerkes in der Signalerkennung. Durch diese Ergebnisse wurde der Einsicht in das molekularen Mechanismus der HAMP Domäne erweitert. Daten von insgesamt 80 Mutanten zeigen, dass die Steuerung des Gleichgewichts zwischen den HAMP-Konformationen durch mehrere Faktoren beeinflusst wird. Diese sind in der jeweiligen AA-Sequenz einer HAMP eingebettet. Die HAMP-Domäne ist nicht nur intern, sondern auch mit benachbarten Domänen für Funktionalität abgestimmt. Dies spricht für eine strenge, extrem individuelle Regulation der Signalübertragung dank der HAMP-Domäne. Angesichts von mehr als 12 000 bekannte HAMP Domänen, deren Sequenzen nur wenige invarianten Reste enthalten, kann angenommen werden, dass jede einzelne in ihrem bestimmten Domänenkontext evolutionär angepasst ist, um nur auf einem definierten Signal Antwort zu geben.